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　　上海酶聯(lián)生物在我司原代細(xì)胞操作中，我們都認(rèn)為實驗的原理似乎很簡單，不外乎固定抗原，添加一抗、二抗和底物，間中夾雜著洗滌和封閉。 

　　原代細(xì)胞培養(yǎng)實驗步驟：

 

　　1、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75%乙醇消毒3-5min。
 

　　2、在超凈工作臺中，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦。
 

　　3、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中。
 

　　4、用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質(zhì)。
 

　　5、大腦皮質(zhì)放于DMEM中(含慶-大霉素和谷-氨酰胺 )，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1%II型膠原酶，0 .025-0 .05%IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。
 

　　6、室溫1 000×g離心8min，去上清液。
 

　　7、沉淀中加入20%BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。
 

　　8、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1%的膠原酶/分散酶，0.05-0.1%I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。
 

　　9、沉淀加入2ml DMEM(含慶-大霉素和谷-氨酰胺)培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50%Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。
 

　　10、靠近底部的紅細(xì)胞層之上的白的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM
 

　　加入DMEM*培養(yǎng)液(20%FBS，4ug/ml嘌呤霉素 )重懸浮，接種于含5%的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含嘌呤霉素的混合培養(yǎng)基，隨后隔天換液。
 

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